فصل سوم مواد و روش ها49
3-1- مواد و دستگاه ها50
3-1-1- مواد شیمیایی و محیط های کشت50
2-1-2-دستگاه ها و وسایل52
3-2- روش ها و آزمایشات53
3-2-1- جداسازی سویه های باکتریایی از سرکه و بررسی تولید سلولز توسط آن ها53
3-2-1-1- محیط کشت هیسترین اسکرام53
3-2-2-انتخاب و شناسایی سویه های باکتریایی54
3-2-2-1-بررسی های فنوتایپینگ سویه های باکتریایی54
3-2-2-1-1-رنگ آمیزی گرم54
3-2-2-1-2- روش لام مرطوب55
3-2-2-1-3-رنگ آمیزی مالاشیت سبز55
3-2-2-1-4-آزمون کاتالاز55
3-2-2-1-5- آزمون اکسیداز55
3-2-2-1-6- آزمون حرکت، ایندول و تولید ( سولفید هیدروژن) (SIM)56
3-2-2-1-7-آزمون ژلاتین56
3-2-3-بررسی های ژنوتایپینگ سویه های باکتریایی56
3-2-3-1-استخراج DNA از میکروارگانیسم ها56
3-2-3-1-1-تهیه محلول – فنل- کلروفرم- ایزوآمیل الکل56
3-2-3-2-نحوه استخراج DNA از میکروارگانیسم ها57
3-2-3-2-1-تهیه ژل آگارز 1%58
3-2-3-3-پرایمرهای مورد استفاده جهت شناسایی مولکولی باکتری ها58
3-2-3-4-واکنش زنجیره پلیمراز برای باکتری ها59
3-2-3-5-تعیین توالی قطعات حاصل از واکنش زنجیره ای پلیمراز60
3-2-4-خالص سازی سلولز تولیدی60
3-2-4-1- شستشو به وسیله هیدروکسید سدیم61
3-2-5-تستهای تایید سلولز61
3-2-5-1-هضم آنزیمی61
3-2-5-1-1-آزمون مولیش و بندیکت61
3-2-5-2-میکروسکوپ الکترونی نگاره62
3-2-6- بررسی تولید نانوذرات نقره توسط استوباکترها و گلوکونوباکترها62
3-2-7-تست های تاییدی تولید نانوذرات نقره62
3-2-7-1- اسپکتروفوتومتری62
3-2-7-2- پراش اشعه ایکس63
3-2-7-3- بررسی توسط میکروسکوپ الکترونی گذاره63
3-2-8- انتخاب سویه های مناسب جهت ادامه آزمون ها63
3-2-8-1-تولید نانوذرات نقره درون بستر سلولزی به روش آر-تی63
3-2-9-بررسی خواص ضد میکروبی لایه سلولزی حاوی نانوذرات نقره63
3-2-9-1-تهیه محلول استاندارد نیم مک فارلند64
3-2-10-نگهداری طولانی مدت سویه ها(روش گلیسرول استوک)64
فصل چهارم نتایج و بحث65
4-1-جداسازی سویه های باکتریایی از سرکه و بررسی تولید سلولز توسط آنها66
4-2-شناسایی سویه های باکتریایی66
4-2-1-بررسی های فنوتایپینگ سویه های باکتریایی66
4-2-1-1خصوصیات ماکروسکوپی66
4-2-1-2- خصوصیات میکروسکوپی67
4-2-1-3- لام مرطوب67
4-2-1-4-رنگ آمیزی مالاشیت سبز67
4-3- آزمونهای بیوشیمیایی68
4-4- بررسی های ژنوتایپینگ سویه های باکتریایی68
4-4-1- استخراج DNA68
4-4-2- تکثیر توالی 16SrDNA69
4-4-3-تعیین توالی قطعات حاصل از واکنش زنجیره پلیمراز70
4-5-نتایج خالص سازی و شستشو توسط NaOH71
4-6-تستهای تاییدی سلولز72
4-6-1-هضم آنزیمی72
4-6-1-1-آزمون مولیش و بندیکت72
4-6-2-بررسی میکروسکوپ الکترونی نگاره72
4-7-بررسی تولید نانوذرات نقره توسط باکتری ها73
4-8-تست های تاییدی تولید نانوذرات نقره73
4-8-1-بررسی توسط میکروسکوپ الکترونی گذاره74
4-8-2-پراش اشعه ایکس74
4-8-3- بررسی اسپکتروفتومتری75
4-9-تولید نانوذرات نقره در درون بستر سلولزی به روش آر-تی76
4-10- بررسی خواص ضد میکروبی لایه سلولزی حاوی نانوذرات نقره76
فصل پنجم نتیجه گیری78
منابع و ماخذ89
چکیده انگلیسیError! Bookmark not defined.

فهرست جداول
جدول2- 1.مثال هایی از تولید نانوذرات فلزی نقره توسط باکتری ها26
جدول 3-1 .مواد شیمیایی و محیط های کشت50
جدول 3-2. لیست دستگاه ها و وسایل مورد استفاده52
جدول 3-3. مواد تشکیل دهنده محیط کشت هیسترین اسکرام54
جدول3-4. توالی پرایمرهای مورد استفاده برای باکتری ها59
جدول 3-5. مراحل انجام واکنش زنجیره ای پلیمراز60
جدول4-1.نتایج تعیین توالی به دست آمده برای نمونه های باکتریایی71
جدول. 4-2 . نتایج اسپکتروفوتومتر برای بهترین نمونه ها75
جدول 4-3 .بررسی خواص ضد میکروبی لایه سلولزی حاوی نانوذرات نقره77
فهرست اشکال
شکل 2-1 . مکانیسم تولید نانوذرات توسط میکروارگانیسم ها15
شکل 2-2 . روند آزاد شدن نانوذرات از پوشاننده ها جهت جلوگیری از رشد پاتوژن ها31
شکل 4-1 . مشاهده میکروسکوپی باسیلهای گرم منفی67
شکل 4-2 . رنگ آمیزی مالاشیت سبز در باسیلوس سرئوس68
شکل 4-3 . نمایش ژل الکتروفورز حاصل از استخراج DNAچند نمونه باکتریایی.69
شکل 4-4 . نمونه ای از غلظت DNA به دست آمده از دستگاه نانودراپ.69
شکل 4-5 . الکتروفورز محصول واکنش زنجیره پلیمراز بر روی ژل آگارز 1%. M: مارکر 1 کیلو جفت باز.70
شکل4-6.خالص سازی لایه سلولز تولیدی71
شکل4-7 . بررسی وجود قند (آزمون مولیش) در سمت راست و بررسی نوع قند(آزمون بندیکت) در سمت چپ72
شکل 4-8 . شکل میکروسکوپ الکترونی نگاره از لایه سلولزی73
شکل 4-9 . بررسی تولید نانوذرات نقره توسط باکتری ها73
شکل 4-10 . مثالی از تصاویر میکروسکوپ الکترونی گذاره که نانوذرات نقره تولیدی توسط باکتری ها نشان می دهد.74
شکل4-11 . نتیجه تست پراش اشعه ایکس برای نانوذرات نقره74
شکل4-12 . نتایج اسپکتروفوتومتر به دست آمده برای نانوذرات نقره که دارای بیشینه جذب در حدود 440 نانومتر است.75
شکل4-13 . تولید نانوذرات نقره در درون بستر سلولزی به روش آر-تی76
شکل 4-14 . بررسی خواص ضد میکروبی لایه سلولزی حاوی نانوذرات نقره77

در این سایت فقط تکه هایی از این مطلب با شماره بندی انتهای صفحه درج می شود که ممکن است هنگام انتقال از فایل ورد به داخل سایت کلمات به هم بریزد یا شکل ها درج نشود

شما می توانید تکه های دیگری از این مطلب را با جستجو در همین سایت بخوانید

ولی برای دانلود فایل اصلی با فرمت ورد حاوی تمامی قسمت ها با منابع کامل

اینجا کلیک کنید

چکیده
فرایند تولید سرکه به لحاظ فیزیولوژیک نوعی واکنش اکسیداسیون ناقص می باشد. از باکتری های تولید کننده سرکه به دو جنس اصلی استوباکتر و گلوکونوباکتر می توان اشاره نمود. این باکتری ها گرم منفی میله ای شکل و هوازی مطلق هستند. توسط تاژه های پری تریش متحرکند، رنگدانه تولید نمی کنند. کاتالاز مثبت هستند و فعالیت اکسیداتیو شدید دارند. استوباکترزایلینیوس،یکی از باکتریهای مولدسلولزاست. نانو” عبارتی یونانی است که معنای 9-10 را داشته و یک نانو یک میلیاردیم می باشد. کاربرد این واژه امروزه بیشتر در نانو تکنولوژی یا فناوری نانو است. نانوذرات نقره، یکی از پر کاربرد ترین ذرات در حوزه نانو می باشد و به‌دلیل خواص فیزیکی و شیمیایی ویژه‌، کاربرد فراوان دارد. در این مطالعه، ابتدا 20 سویه از باکتری تولید کننده سلولز از سرکه جداسازی و شناسایی گردید، سپس 5 سویه جهت مطالعات بیشتر انتخاب و DNA آن ها استخراج و واکنش زنجیره پلیمراز( PCR) انجام گردید و نهایتا با استفاده از پرایمر های اختصاصی تعیین توالی شد. بعد از طی مراحل خالص سازی و تایید لایه سلولزی، تولید نانوذرات نقره توسط باکتری های فوق بررسی و سپس این 5 سویه با توانایی تولید نانوذرات نقره و سلولز تایید شد و نهایتا خواص ضد میکروبی آن ها جهت پوشانندگی زخم ها مورد بررسی قرار گرفت.
کلمات کلیدی :گلوکونوباکتر،استوباکتر، نانوذرات نقره، سلولز
فصل اول
مقدمه
1-1-مقدمه ای در مورد سرکه و تاریخچه آن
قدمت تولید سرکه حاقل به 400 سال قبل از میلاد مسیح می رسد (Deppenmeier, 2002)، و فرایند تولید آن به لحاظ فیزیولوژیک1نوعی واکنش اکسیداسیون ناقص می باشد. اولین توصیف درباره تولید سرکه توسط پاستور در سال 1862 انجام گرفت. او دریافت که مادر سرکه توده ای از ارگانیزم های زنده است که عامل اکسیداسیون اتانول به اسید استیک می باشد. باکتری های استوباکتر استی2 و گلوکونوباکتر سابکسی3 به ترتیب توسط Beijerink در سال 1898 و De leeuw و Kluyver در سال 1924 توصیف شدند (Moonmangmee, 2000). Asai در سال 1934 و بار دیگر در سال 1968، این باکتری ها را به دو جنس اصلی استوباکتر و گلوکونوباکتر رده بندی کرد (Higgins, 1990). این دو جنس با تغییراتی همچنان بخشی از خانواده استوباکتریاسه را با 12 جنس به خود اختصاص داده اند.
1-2-مقدمه، خصوصیات و کاربرد های استوباکتر ها و گلوکونوباکتر ها
جنس استوباکتر دارای سه گونه می باشد.باکتری گرم منفی4 میله ای شکل و هوازی مطلق5 است. در صورت متحرک بودن به وسیله فلاژل های پری تریش6 متحرک اند(Brenner et al., 2005). این باکتری ها الکل را به آب و کربنیک، لاکتات را به کربنات تبدیل و بعضی از اسید های آمینه را تجزیه می کنند. استوباکترها عموماً در جو تخمیر شده، سرکه و میوه ها و سبزی های ترش یافت می شود. برخی گونه ها مانند استوباکتراستی (A.aceti) اتانول را به اسید استیک، اکسید کرده و کاربرد صنعتی در تولید سرکه دارند،به همین دلیل به استوباکترها، اسید استیک باکتری هم گفته می شوند.این باکتری ها در جوانی گرم منفی و سلول های پیر اکثراً گرم متغییراند. در زیر میکروسکوپ به شکل تک تک، دو تایی و یا به صورت زنجیره دنبال هم مشاهده می شوند. در حین تولید سرکه به هم پیچیده گاه به شکل کوکسی مانند و گاه رشته ای و بلند در می آیند. محیط اسیدی را خوب تحمل می کنند. نسبت به سودوموناس7 ها تحرک کمتری دارند و رنگدانه تولید نمی کنند. کاتالاز مثبت هستند و فعالیت اکسیداتیو شدید دارند.این ارگانیسم ها را به دو گروه استوباکترهای با اکسایش شدید8 که موقتاً ایجاد اسید استیک می نماید و آنرا دوباره تجزیه می کند و استوباکترهای با اکسایش جزئی9 که اسید استیک تولید شده را دیگر تجزیه نمی کند،تقسیم می نمایند. از گروه استوباکترهای با اکسایش شدید می توان استوباکتر پراکسیدانس10، استوباکتر پاستوریانوم11 و از استوباکترهای با اکسایش جزئی می توان گلوکونوباکتراکسیدانس12 را نام برد. ما بین این دو گروه باکتریهای استوباکتر گزیلینوم13 ، استوباکتر استی و استوباکتر اسیدوفیلوم14 قرار دارند((Garrity, 2002 . این باکتری ها در صنایع غذایی جهت تولید اسید استیک و ویتامین ث اهمیت فراوانی دارند. استوباکتر زایلینیوس، یکى از باکترى هاى مولد سلولز Cellulose است و می تواند گلوکز، گلیسرول و سایر منابع آلی را به سلولز خالص تبدیل کند( and Canon, 1989 Fontana et al., 1991; Williams ). سلولز میکروبى تولید شده توسط استوباکتر زایلینیوس به عنوان یکى از با ارزش ترین پلیمر های زیستی در زمینه هاى گوناگون پزشکى کاربرد دارد.. کاربردهاى متعددى از سلولزمیکروبى در پزشکى، دامپزشکى، صنایع غذایى، نفتى،پوشاکى، آرایشی، بهداشتى و غیره شناخته شده است2001;Kobayashi et al., 2006) ., et al Klemm).
استفاده از سلولز میکروبی براى اولین بار در سال 1980،به عنوان پانسمانى پوشیده شده با مایع برای بهبود زخم انجام گرفت (Klemm et al., 2001) .فونتانا و همکارانش از سلولزمیکروبی، محصولی را با نام بیوفیلم تولید کردند و جهت سوختگی های درجه دوم و سوم، زخم های عمیق، پیوند پوست و به طور کلی برای درمان آسیب های پوستی به کار گرفتند(Fontana et al., 1991 ).
1-3- مقدمه و کاربردهای نانوذرات نقره
نانو” عبارتی یونانی است که معنای 9-10 را داشته و یک نانو یک میلیاردیم می باشد. کاربرد این واژه امروزه بیشتر در نانو تکنولوژی یا فناوری نانو است( Narayanan and Sakthivel, 2010 ). از میان انواع مختلف نانوذرات، پرکاربردترین آن ها نانوذرات نقره است. نانو ذرات نقره، یکی از پر کاربرد ترین ذرات در حوزه نانو پس از نانو لوله های کربن است، که هر روزه بر کاربرد آن در دنیای نانو افزوده می شود.
نانوذرات نقره عمدتاً، به‌دلیل خواص فیزیکی و شیمیایی ویژه‌ای که از خود نشان می‌دهند در مصارف الکترونیکی، نوری، دارویی و بهداشتی و کاتالیتیکی کاربرد فراوان دارند. یکی از دلایل کاربرد گسترده این ذرات ، به دلیل خاصیت آنتی باکتریال این ذرات است و در واقع نانوذرات نقره برای عوامل بیماری‌زا یک سم تلقی می‌شوند و ‌برای بدن انسان، غذاها و بافت‌ها بی‌ضررند. این در حالی است که نقره به خودی خود فاقد و یا خیلی کمتر این خاصیت است. این خاصیت دوگانه ذرات نانو در مقایسه با ذرات ماکروی نقره به دلیل اثر افزایش سطح در نتیجه افزایش واکنش پذیری ماده و پیروی ماده از فیزیک و شیمی کوانتم15 در حالت نانو است. خصوصیات نانو ذرات نقره شامل: تاثیر بسیار زیاد، تاثیر سریع، غیر سمی بودن، غیر محرک برای بدن، غیر حساسیت زا، قابلیت تحمل شرایط مختلف (پایداری زیاد)، آب دوست بودن، سازگاری با محیط زیست، مقاوم در برابر حرارت، عدم ایجاد و افزایش مقاومت و سازگاری در میکروارگانیسم میباشد. نقره در ابعاد بزرگتر، فلزی با خاصیت واکنش دهی کم می باشد، ولی زمانی که به ابعاد کوچک در حد نانومتر تبدیل می شود خاصیت میکروب کشی آن بیش از 99 درصد افزایش می یابد، به حدی که می توان از آن جهت بهبود جراحات و عفونت ها استفاده کرد. نقره در ابعاد نانو بر متابولیسم، تنفس و تولید مثل میکروارگانیسم اثر می گذارد. تاکنون بیش از 650 نوع باکتری شناخته شده را از بین برده است. هر چند این فناوری به تازگی مورد توجه زیادی قرار گرفته و رونق بسیاری پیدا کرده ، اما از آن در طب قدیم استفاده می شده بدون آنکه دلیل تاثیر آن شناخته شود و حتی در جنگ برای کنترل عفونت زخم سربازان از سکه های نقره استفاده می شده است (Rai et al., 2009).
فصل دوم
مروری بر تحقیقات گذشته
2-1-مقدمه
“نانو” عبارتی یونانی است که معنای 9-10 را داشته و یک نانو یک میلیاردیم می باشد. کاربرد این واژه امروزه بیشتر در نانو تکنولوژی یا فناوری نانو است. نشانه اختصاری نانو در سیستم متریک n می‌باشد. فناوری نانو یا نانوتکنولوژی رشته‌ای از دانش است که به مطالعه مواد، دستگاه ها و سیستم هادر ابعاد نانو می پردازد و موضوع اصلی آن مهار ماده یا دستگاه‌های در ابعاد کمتر از یک میکرومتر، معمولاً حدود ? تا ??? نانومتر است. این دانش به فهم و به کارگیری خواص جدیدی از مواد و سیستمهایی در این ابعاد پرداخته که اثرات فیزیکی جدیدی، عمدتا متاثر از غلبه خواص کوانتومی بر خواص کلاسیک، از خود نشان می‌دهند. همچنین موجودات زنده از سلول هایی که به طور معمول دارای طولی حدود 10 میکرومتر است، ساخته می شوند با این حال بخش های درونی سلول ها بسیار کوچک بوده و در اندازه کمترازیک میکرون است.برای مثال کوچکترین پروتئین ها دراندازه معمولی 5 نانومتر می باشند که این اندازه قابل مقایسه باکوچکترین ابعاد نانو ذرات ساخته شده توسط انسان است(Narayanan and Sakthivel, 2010 ).
نانوفناوری یک دانش بین ‌رشته‌ای است و به رشته‌هایی چون فیزیک کاربردی، مهندسی مواد، شیمی ابرمولکول و حتی مهندسی مکانیک، مهندسی برق، مهندسی شیمی و رشته های بیولوژی نیز مربوط می‌شود. تحقیقات در زمینه نانوتکنولوژی به صورت گسترده ای انجام شده و دستیابی به مواد جدیدی در ابعاد نانو مانند نانوذرات، نانولوله ها، نانوسیم ها و … میسر شده است.
در میان این مواد، نانوذرات به دلیل خواص منحصر به فرد خود در خواص شیمیایی، الکترونیکی و مگنتیکی16 بسیار مورد توجه قرار گرفته اند( Zhang et al ., 2011).
زمینه‌هایی که نانوذرات در آن ها کاربرد دارند، شامل کاربرد نانوذرات در مواد کاتالیزور، کامپوزیت17، افزودنی‌های سوخت و مواد منفجره، بسته‌بندی و روکش‌ها، ساینده‌ها18، روان‌کننده‌ها، پزشکی و داروسازی، باتری‌ها و پیل‌های سوختی،دارو رسانی، محافظت‌کننده‌ها، آنالیز زیستی و تشخیص پزشکی و لوازم آرایشی می شود. پزشکی نانو، بهره‌گیری از فناوری نانو در امور پزشکی است. این شاخه از پزشکی می‌کوشد تا با استفاده از فناوری نانو، به تشخیص بیماری‌ها، پیشگیری از آن‌ها و معالجه بیماران بپردازد. از جمله کاربردهای نانوذرات در زیست شناسی و پزشکی می توان به:شناساگرهای بیولوژیکی فلورسنت19
Bruchez et al., 1998; Chan and Nie, 1998; Wang et al., 2002) ) تشخیص پاتوژن ها(Edelstein et al., 2000)، شناسایی پروتئین ها(et al., 2003 Nam )، کاوش ساختار (Mahtab et al., 1995) DNA، مهندسی بافت20(et al., 2003 de la IslaMa)، تخریب تومور از طریق حرارت دادن (هایپرترمی )21(( Yoshidaand Kobayashi, 1999، افزایش کنتراست22 در MRI( (Weissleder et al., 1990 و…اشاره نمود.
همچنین افزایش رسانش دارویی یکی از کاربردهای نانو پزشکی23 است که در آن با استفاده از مواد نانو کوشش می شود تا میزان فراهمی زیستی داروها افزایش یابد. فراهمی زیستی، به میزان وجود دارو در بخش‌هایی از بدن نظر دارد که به آن دارو نیاز دارند یا کارکرد دارو در آن محل‌ها بیشتر مورد نیاز است. در رسانش دارویی سعی می شود که میزان فراهمی زیستی را در محل‌هایی خاص از بدن و حتی در زمان‌هایی خاص، افزایش دهند. چنین کاری به وسیله‌ی ابزارهای نانو امکان‌پذیر است و به عنوان نمونه، موفقیت‌هایی در زمینه‌ی ارسال مستقیم داروهای مربوط به شیمی درمانی، به سلول‌های سرطانی صورت گرفته است. در حال حاضر، یکی از مشکل‌های اساسی در درمان سرطان‌های مختلف آن است که داروها، هم برای سلول‌های سرطانی و هم برای سلول‌های سالم، به یک اندازه می‌توانند سمی باشند، در نتیجه در شیمی ‌درمانی آن‌جا که آسیب‌ها برای سلول‌های سالم رو به فزونی باشد، با محدودیت اساسی مواجه می‌شود. از طریق نشان گذاری سلول‌های سرطانی و افزایش رسانش دارویی می‌توان بر این مشکل اساسی پیروز شد. نانومواد سرامیکی، میسل‌های24 پوشیده شده با سیلیس و لیپوزوم های25 با پیوند عرضی می‌توانند برای این منظور، مورد استفاده قرار گیرند. همچنین نانوذرات سرامیکی به عنوان کاتالیزوربوده ودر مهندسی بافت و اصلاح و ترمیم عیوب استخوانی استفاده می شوند(Thakkar et al., 2010 )
علاوه بر این دیگر کاربردهای مورد استفاده از نانوذارت نقره در زیر به صورت خلاصه آورده شده اند.
نانوذرات نقره به دلیل خواص فیزیکی و شیمیایی ویژه ای که از خود نشان می دهند در مصارف الکترونیکی،نوری، دارویی، بهداشتی و کاتالیکی کاربرد زیادی دارند بنابراین سنتز آن از اهمیت بالایی برخوردار است(kan – sen and Yueh – sheng, 2003) . همچنین نانوذرات نقره درمتابولیسم26،تنفس وتولیدمثل میکروارگانیزم ها اثر دارند وبه صورت پایه فلزی، پایه یونی (AgNo3)، کامپوزیتی (Sio2,Tio2) موجود می باشند. نقره به صورت نانوذره دارای قدرت و انحلال زیادی بوده و به صورت کلوئیدی در محلولی به حالت سوسپانسیون (کلوئیدی جامد در مایع ) وجود دارد و این نقره کلوئیدی در پانسمان زخم ها قابل استفاده است.
نشان داده شده است چنانچه اکسیدآهن3 Fe3O4 به نانوذرات نقره متصل گردد، می توان از مخلوط حاصل در پاکسازی و تیمار آب استفاده نمود. سپس می توان به راحتی و با استفاده از میدان مغناطیسی دوباره نانوذرات را جداسازی نمود که به این ترتیب نه تنها در هزینه ها صرفه جویی می شود بلکه از آلودگی محیطی توسط نانوذرات نقره و اکسید آهن جلوگیری خواهد شد(et al., 2007 Gong ).
2-2-تاریخچه استفاده از نانوذرات
نانوذرات از زمانهای بسیار دور مورد استفاده قرار می گرفته است. شاید اولین استفاده آنها در لعاب های چینی و سرامیک های تزئینی سلسله های ابتدایی چین در قرن 4 و 5 میلادی بوده است. علاوه بر این در یک جام رومی موسوم به جام لیکرگوس27 نیز از نانو ذرات طلا استفاده شده است تا رنگهای متفاوتی از جام بر حسب نحوه تابش نور پدید آید، البته علت چنین اثراتی برای سازندگان آنها ناشناخته بوده است. کربن سیاه مشهورترین مثال از نانوذراتی است که ده ها سال به طور انبوه تولید شده است و در لاستیک اتومبیل به منظور افزایش طول عمر آنها به کار رفته است و علت رنگ سیاه لاستیک نیز، وجود این افزودنی سیاه رنگ است.گذشته از آن، در دهه 1930 برای اولین بار روشهای فرآوری بخار جهت تولید نانو ذرات بلوری مورد استفاده قرار گرفته شد.
در سال های اخیر پیشرفت های بسیار بزرگی در زمینه امکان ساخت نانوذرات از مواد گوناگون وکنترل شدید بر روی اندازه، ترکیب و یکنواختی آنها صورت گرفته است ( et al., 2006 Panacek).
2-3-روش های تولید نانوذرات
تولید نانوذرات فلزی
تولید نانوذرات فلزی با آزمایش مایکل فاراده آغاز شد. در روش احیافاراده نانو ذرات طلا با ابعاد 30-3 نانومتررا در محلول حاوی تتراکلرو اوریک اسید28(Aucl4) ایجاد نمود که در این روش فسفر به عنوان دهنده الکترون عمل می نماید(kan – sen and Yueh – sheng, 2003).
به طور کلی جهت تولید نانوذرات دو روش وجود دارد:
1-روش پایین به بالا
دراین روش رویکرد از پایین به بالا بوده و اشاره به ساخت اتم به اتم، مولکول به مولکول یا حالت خوشه ای دارد که ابتدا نانو ذرات شکل گرفته و در ادامه با استفاده از مواد شیمیایی یا بیولوژیکی تولید آن تکمیل می گردد. باید توجه داشت که اتم‌ها و مولکول‌ها همیشه در جایی که مورد نظر است قرار نخواهند گرفت و عاملی که محل قرارگیری آنها را تعیین می‌کند انرژی آنها است. به این صورت که مولکول‌ها در جایی قرار خواهند گرفت که کمترین انرژی آزاد را داشته باشند و به سمت انرژی آزاد منفی تمایل دارند. انرژی آزاد در یک سیستم به ‌وسیله استحکام پیوند و انتروپی29 تعیین می‌شود در این روش امکان ایجاد نانو ذرات فلزی با نقص کم و ترکیب شیمیایی همگن وجود دارد.
2-روش بالا به پایین
این روش عکس روش بالا بوده و با یک سری از ابزارها مواد اولیه خرد وکوچک می شوندتا به ابعاد نانو برسند که عمدتاطی فرایندفیزیکی (مکانیکی) یا شیمیایی است. از اشکالات عمده این روش نقص در ساختارهای سطحی است که اثر قابل توجهی بر خواص فیزیکی وشیمیایی سطح نانوذرات فلزی با توجه به ابعاد آن می گذارد(et al., 2010 Thakkar).
به طور عمده سنتز نانوذرات فلزی عمدتا با روش های فیزیکی و شیمیایی انجام گرفته و دارای مشکلاتی ازجمله استفاده از حلال های سمی، تولید محصول خطرناک و مصرف انرژی است. یک روش امیدبخش در تولید نانوذرات استفاده از مجموعه ای از منابع بیولوژیکی30 در طبیعت اعم از گیاهان، جلبک ها، قارچها، باکتری ها و ویروس هادر چندسال گذشته می باشد که بسیار کم هزینه عمل نموده وغیرسمی است. در ذیل به صورت خلاصه روش های شیمیایی، فیزیکی و بیولوژیک در تولید نانوذرات فلزی توضیح داده می شوند. (Thakkar et al.,2010 )
2-3-1-تولید فیزیکی
این روش یک نمونه از روش‌های بالا به پایین است و براساس متلاشی شدن ساختار دانه‌های درشت استوار است. در این فرایند، با استفاده از یک آسیاب ساچمه‌ای31 با صرف انرژی بالا، مخلوط پودرهای مختلف را در سطح اتمی با یکدیگر آسیاب و ترکیب می‌کنند. با استفاده از این تکنیک علاوه بر پودرهای عنصری خالص از پودرهای آلیاژی و سرامیک‌ها، نظیر اکسیدها32، نیتریدها33 و غیره برای ایجاد آلیاژها34 و کامپوزیت‌ها35 استفاده می‌شود. به این ترتیب با سایش مکانیکی همراه با خرد شدن، می توان به ابعاد نانو از یک ماده جامد دست یافت. شکست دانه‌ها به علت انرژی می باشد که به آنها انتقال داده می‌شود، که این انرژی به سرعت دورانی یا ارتعاشی، محفظه و مدت سایش در حین فرآیند سایش بستگی دارد. از جمله معایب این روش می توان به آلودگی و ناخالصی ناشی از ماده ساینده، ایجاد ساختار خشن در پودرهای تولیدی، عدم یکنواختی در اندازه دانه‌ها و ترکیب شیمیایی غیر یکنواخت نانوذرات تولیدی اشاره نمود.
از روش های فیزیکی به دلیل میزان تولید کم و هزینه زیاد استقبال چندانی نشده است.علاوه بر این، این روش ها نیاز به انرژی لازم برای حفظ فشار بالا و حرارت مورد استفاده در ساخت دارند.این در حالی است که اکثر فرآیندهای زیستی تحت فشار هوا و دمای طبیعی(تولید بیولوژیک) رخ می دهند که موجب صرفه جویی در مصرف انرژی شده که این نوعی مزیت نسبت به روش فیزیکی تولید نانوذرات محسوب می شودet al., 2010; Li et al., 1999) Thakkar )
2-3-2-تولید شیمیایی
در این روش جهت جلوگیری از تراکم نانوذرات فلزی و ایجادپایداری در نانوذرات می توان از موادی همچون سدیم دودسیل بنزیل سولفات36(et al., 1999 Li) یا پلی وینیل پیرولیدون37(et al., 2003 Tan) استفاده نمود . روش های شیمیایی تولید نانوذرات در حجم زیاد کم هزینه بوده ولی مشکلاتی همچون آلودگی حاصل از مواد شیمیایی، حلال های سمی و محصولات خطرناک را دارد. از روش های تولید شیمیایی نانوذرات رایج ترین روش احیای شیمیایی محلول نمک های نقره است که توسط عامل احیایی نظیر (NaBH4)، سیترات38 و آسکوربات39 صورت می گیرد(sondi et al., 2003). از دهنده های الکترون در این روش می توان به بروهیدرید اشاره نمود که توانایی احیاء نانوذرات را دارد.با این حال کنترل واکنش مشکل است و به همین دلیل می توان از احیاکننده های ضعیف تر مانند سیترات استفاده نمود که گرچه سرعت احیا کمتری دارد ولی می تواند واکنش را کنترل نماید((Schneider et al., 1994. علاوه بر این سنتزنانو ذرات نقره به وسیله امواج مایکروویو در محیط الکلی قابل انجام است. ساخت نانوذرات از این طریق دارای مزایایی از جمله : واکنش سریع، تمیز بودن ساز و کار عمل، اقتصادی ومقرون به صرفه بودن می باشد.هم چنین واکنش مایکروویو در زمان کوتاهی انجام پذیر است.در تولید شیمیایی نانوذرات می توان به رشد نانوذرات در یک واسط مایع با واکنش دهنده های مختلف به ویژه عوامل کاهنده مانند بروهیدرید سدیم40(et al., 2007 Kim) ، بی تار تارات پتاسیم41(et al., 2003 Tan)،متوکسی پلی اتیلن گلیکول42(et al., 2004 Mallick) یا هیدرازین43(et al., 1999 Li) اشاره نمود.
تولید به صورت شیمیایی شامل انواع روش ها نظیر سل ـ ژل، واکنش حالت‌های جامد ـ مایعو چگالش فاز گازی می باشد که مختصرا توضیح داده می شوندet al., 2010) Thakkar).
2-3-2-1- سل ـ ژل
سل ژل عبارتست از یک فرآیند خودآرایی به ‌هم پیوستگی یا انباشتگی که در طی آن نانو مواد تشکیل می‌شوند.
کلوئیدی که در یک مایع معلق شده است سل و سوسپانسیونی که شکل خودش را حفظ می‌کند ژل نامیده می شوند. در نتیجه سل ‌ـ ژل‌ها سوسپانسیون‌هایی از کلوئید‌ها در مایعات هستند که شکل را نگه می‌دارند. فرآیند سل ـ ژل همان‌طوری که از نامش پیداست مستلزم تکمیل تدریجی شبکه‌ها از طریق تشکیل یک سوسپانسون کلوئیدی (سل) و ژله‌ای شدن سل جهت تشکیل شبکه‌ای در یک فاز مایع پیوسته (ژل) است. پیش ماده‌های لازم برای تولید این کلوئید‌ها عموما شامل یون‌هایی از یک فلز است. تشکیل سل ـ ژل در چهار مرحله به‌وقوع می‌پیوندد:
1.هیدرولیز، 2.تراکم و پلیمری شدن منومر‌ها برای تشکیل ذرات، 3.رشد ذرات، 4.به‌هم چسبیدن ذرات و توده‌ای شدن آنها از طریق تشکیل شبکه‌هایی که در سراسر محیط مایع گسترش یافته‌اند سبب زخیم شدن آنها می‌شود که نهایتا تشکیل یک ژل را خواهند دادet al., 2010) Thakkar).
2-3-2-2- واکنش حالت‌های جامد ـ مایع
این روش شامل رسوب ذرات از درون فاز محلول بر روی یک هسته اولیه می باشد که بنابراین فرآیند آن بر پایه وجود هسته مورد نظر استوار است.
برای مثال پودر دی اکسید تیتانیوم با اندازه‌های بین 70 تا 300 نانومتر با استفاده از این روش، از تیتانیوم تترا ایزو پروپوکساید44 به عنوان هسته اولیه تولید می‌شودet al., 2010) Thakkar).
2-3-2-3- چگالش فاز گازی
این روش به‌طور کلی بر مبنای پیرولیز ماده اصلی تولید کننده نانو ذرات استوار است و فرآیند آن بدین‌گونه است که یک گاز بی‌اثر و خالص وارد محفظه حاوی مایع اصلی تولید نانو ذرات می‌شود. مایع در این محفظه توسط یک مشعل تجزیه شده و به‌وسیله گاز حامل به مبرد فرستاده می‌شود. بخارات در مبرد سرد شده و به صورت دانه یا خوشه در می‌آیند. اندازه دانه‌های تولید شده در این روش به عواملی همچون نوع گاز بی‌اثر به‌کار برده شده، فشار گاز بی‌اثر، زمان باقی ماندن ذرات در محدوده رشد و نسبت نرخ تبخیر به فشار بخار ماده تبخیر شده بستگی دارد. از مزایای این روش می توان به توانایی کنترل بهینه بر روی اندازه دانه‌ها و خلوص محصولات تولیدی در سیستم‌های تولید خلاء اشاره نمود . از معایب آن نیز می توان به بالا بودن قیمت تجهیزات و عدم امکان تولید در ابعاد صنعتی اشاره کرد et al., 2010) Thakkar).
2-3-3-تولید بیولوژیکی
تولید بیولوژیکی اشاره به روندی دارد که توسط روش های بیولوژیکی و روندهای آنزیمی رخ می دهد. این روش ها به دلیل اینکه مواد سمی در محیط تولید نمی نمایند، به نام تکنولوژی سبز نیز خوانده می شوند که در طی آن می توان نانوذرات فلزی بهتری نسبت به انواع دیگر تولید نمود.در تولید بیولوژیک خارج سلولی یا داخل سلولی نانوذرات از هر دو نوع موجودات تک سلولی و پرسلولی استفاده می شود. منابع طبیعی و باکتری های پروکاریوتی گسترده ترین منابع ساخت نانوذرات فلزی می باشند.از دلایل اصلی استفاده از باکتری ها در ساخت نانوذرات سهولت نسبی در دستکاری آنهاست. تولید به روش بیولوژیک نسبت به دو روش فیزیکی و شیمیایی بنا بر دلایل زیر بسیار بهتر عمل می نماید:
تولید بیولوژیکی نانوذرات فلزی قابلیت تجاری بالاتری داشته و در مصرف انرژی کم هزینه تر عمل می نماید به طوریکه در مقایسه با روش های فیزیکی و شیمیایی که نیاز به دما و فشار هایی بالا دارند، معمولا کم هزینه و آسان می باشد.
همچنین این روش، سرعت تولید بالاتری در مقایسه با روش های معمول، به خصوص در نوع فیزیکی، دارد(Bansal V Rautaray et al., 2004; Mukherjee et al., 2002 ) .
تولید در سطح بالا در روش های فیزیکی و شیمیایی معمولا سبب افزایش اندازه ذرات شده که از میکرومتر تجاوز می نماید، در حالیکه روش بیولوژیکی می تواند به صورت موثری در تولید نانوذره ها با اندازه کوچک ولی در حجم بزرگ عمل نماید(et al., 1999 Klaus ).
این روش، روشی تمیز، غیر سمی و دوستدار طبیعت می باشد(et al., 2005 Senapati ).
از دیگر مزایای استفاده از روش بیولوژیک جهت تولید نانوذرات فلزی کنترل دقیق شرایط واکنش، تولید نانوذرات مناسب و سازگار با بدن انسان و جلوگیری از استفاده از محلول های آلی سمی در طی مراحل تولید است. علاوه بر این باکتری ها به راحتی قابل کنترل می باشند و در موارد پیشرفته تر می توان آن ها را به صورت ژنتیکی دستکاری نمود. مشکلی که در این روش ها محسوس است، نیاز به روش مناسب جهت تخلیص و استخراج نانوذرات تولیدی می باشد. علاوه بر این باکتری های پاتوژن توانایی آلوده سازی کشت های میکروبی باکتری های تولید کننده نانوذرات را دارا بوده و به این ترتیب توانایی استفاده مستقیم از نانوذرات تولیدی در پزشکی را تحت الشعاع قرار می دهند ( et al., 2006 Sweeney ).
2-4- مکانیسم تولید نانوذرات توسط میکروارگانیسم ها
میکروارگانیسم ها به دلیل توانایی در برخورد مناسب با شرایط استرس، می توانند بر روی غلظت های بالایی از یون های فلزی رشد نموده و زنده بمانند. در این حالت یون های سمی فلزی موجود در محیط به وسیله فرایندهای عمدتا آنزیمی احیاء شده و فلز تولیدی در این مسیر در درون و یا بیرون از سلول ذخیره می شود(et al., 2011 Zhang). سایر مکانیسم هایی که میکروب ها در این شرایط می توانند مورد استفاده قرار دهند شامل استفاده از سیستم های جریان یونی45، تغییر در حلالیت و سمیت یون ها از طریق اکسیداسیون و احیاء، ایجاد پلی ساکاریدهای میکروبی خارج سلولی جهت رسوب فلزات و یا نداشتن سیستم های انتقال یون فلزی به درون سلول می باشد. با این حال همانگونه که اشاره شد، حالتی که بیشتر اتفاق می افتد احیاء بیولوژیکی فلزات توسط سیستم های آنزیمی مختلف می باشد. در این حالت سلول های میکروبی یون های فلزی را به وسیله استفاده از آنزیم های خاص مانند NADH ردوکتاز46 و یا نیترات ردوکتاز47 احیاء می نمایند .
شکل 2-1. مکانیسم تولید نانوذرات توسط میکروارگانیسم ها
در کنار فعالیت و عمل آنزیم ها، فاز رشد میکروارگانیسم ها نیز در تولید نانوذرات موثر می باشد. برای مثال مشاهده شده است که سلول های ورتیسیلیوم لوتئوآلبوم48جمع آوری شده در فازهای مختلف رشد، میزان متفاوتی از نانوذرات را تولید می نمایند (Gericke and Pinches, 2006 ). برای مثال سلول هایی که از انتهای فاز سکون جمع آوری شده بودند نسبت به سلول هایی که در ابتدای این فاز جمع آوری شده اند تعداد بسیار کمتری از نانوذرات را تولید نموده اند.
تقریبا در تمامی روش های تولید شیمیایی نانوذرات، یک ماده پایدار کننده مورد نیاز می باشد تا از تجمع و به هم پیوستن ذرات نانو جلوگیری نماید. به صورت معکوس، در تصاویر حاصل از نانوذرات به دست آمده با روش بیولوژیکی در میکروسکوپ الکترونی TEM، نشان داده شده است که حتی در تجمعات و توده هایی از نانوذرات نیز، این مواد با هم تماس مستقیم ندارند که احتمالا نانوذرات تولیدی در محلول به وسیله پروتئین هایی به نام پروتئین های پوشش دهنده 49 پایدار می شوند که این پروتئین ها از باکتری ها به درون محیط ترشح شده اند. از مواد دیگری که به عنوان کلاهک قابل استفاده می باشند، می توان به سیترات اشاره نمود که جهت جلوگیری از ایجاد توده و یا جلوگیری از به هم پیوستن نانوذرات تولیدی مورد استفاده قرار می گیرد(Mollazadeh Moghaddam, 2010).
از طرفی مشاهده شده است که نانوذرات فلزی می توانند هم به صورت خارج سلولی (به دلیل ترشح مواد سلولی و آنزیم ها به خارج از سلول) و هم به صورت داخل سلولی قابل تولید اند. بنابراین تعیین مکان تولید نانوذرات که درون سلولی یا برون سلولی باشد، وابسته به محل و مکانیسمی است که طی آن نانوذرات شکل می گیرند(Simkiss and Wilbur, 1989 ; Mann, 1996 ) .
روش درون سلولی مبتنی بر انتقال یون های سمی به درون سلول های میکروبی جهت تولید نانوذرات است که در حضور آنزیم های درون سلولی این واکنش هدایت می شود در حالیکه روش برون سلولی مبتنی بر به دام اندازی یون های فلزی در خارج از سلول بوده که احیاء یون های فلزی در حضور آنزیم های برون سلولی به وقوع می پیوندد( Zhang et al., 2011). تا به حال بسیاری از میکروب ها مانند باکتری های مگنتوتاکتیک50 Blackmore, 1982))، قارچ ها(et al., 2000 Bruins)، دیاتوم ها51(Mann, 2001)، اکتینومایست ها52( (Ahmad et al., 2003 و مخمرها (et al., 2009 Mithila) جهت تولید کریستال های معدنی در ابعاد نانو و نانوذرات فلزی استفاده شده اند و کنترل بر روی شکل، اندازه ترکیب نانوذرات نیز به صورت زیادی مطالعه شده است(Zhang et al., 2011).
مطالعات نشان داده اند که تقریبا تمامی سویه های قارچی که دارای توانایی تولید نانوذرات فلزی بوده اند، فلز را به صورت خارج سلولی رسوب داده اند. تولید خارج سلولی در مقایسه با تولید داخل سلولی مناسب تر است زیرا نانوذرات در فرم داخل سلولی در داخل توده سلولی تولید می شوند، بنابراین مرحله ای دیگر نیز مورد نیاز است تا بتوان نانوذرات را ازتوده سلولی جداسازی نمود که در این حالت باید از امواج اولترا سونیک53 و یا دترجانت های مناسب استفاده کرد در حالیکه این مرحله در مورد تولید خارج سلولی قابل حذف می باشد. نتیجتا دلیل فوق، روش تولید به صورت خارج سلولی را کم هزینه تر نموده است. به این دلیل و نیز به دلیل اینکه تولید نانو مواد در روش درون سلولی همیشه عملی نمی باشد، اکثر مطالعات بر روی روش های برون سلولی متمرکز شده اند(et al., 2007 Minaian).


پاسخ دهید